Сразу после начала Великой Отечественной войны Павличенко рвалась на фронт. Пройдя краткосрочные снайперские курсы, она стала бойцом 25-й Чапаевской стрелковой дивизии РККА, которую сразу направили на приграничные сражения.Павличенко воевала в Молдавии, участвовала в обороне Одессы и Севастополя.К июню 1942 года на счету Людмилы Павличенко было 309 подтвержденных ликвидированных вражеских солдат и офицеров, в том числе тридцать шесть снайперов. Выживая в немыслимых условиях и неустанно сражаясь против фашистских оккупантов, она успевала передавать свое мастерство и опыт другим, активно обучая новых снайперов.После тяжелого ранения доблестного снайпера эвакуировали из находившегося в осаде Севастополя. Когда отозванная с передовой Людмила восстановила здоровье и силы, ее в составе советской молодежной делегации отправили в заокеанскую поездку. Во время визита в Канаду и Соединенные Штаты Павличенко пригласили на прием к американскому президенту Франклину Делано Рузвельту. Позже первая леди США Элеонора Рузвельт, с большой симпатией встретившая советского снайпера, организовала для делегации из СССР поездку по своей стране.

Лейтенанту Павличенко представилась возможность выступать перед Международной студенческой ассамблеей в Вашингтоне, перед Конгрессом промышленных организаций (CIO) в Нью-Йорке, а также в Чикаго, где она произнесла знаменитую фразу: «Джентльмены, мне двадцать пять лет. На фронте я уже успела уничтожить триста девять фашистских захватчиков. Не кажется ли вам, джентльмены, что вы слишком долго прячетесь за моей спиной?». 

Американский певец-социалист Вуди Гатри в 1946 году создал песню Miss Pavlichenko, вдохновившись выступлениями снайпера в США.

Позже Павличенко еще раз встретится с американской первой леди, когда Элеонора Рузвельт приедет с официальным визитом в Советский Союз. Мемуары американки, где она рассказывает о знакомстве с Людмилой Павличенко, стали основой для фильма «Битва за Севастополь», который вышел на экраны в 2015 году. В образе выдающегося советского снайпера предстала российская актриса Юлия Пересильд.

25 октября 1943 года Людмила Павличенко была удостоена звания Героя Советского Союза. На фронт она больше не вернулась.